單細(xì)胞中內(nèi)容物體積少、含量低、種類多、分析窗口有限，使得高靈敏、高信息覆蓋度、快速、高通量的單細(xì)胞分析面臨重大挑戰(zhàn)。通過(guò)單次測(cè)量實(shí)現(xiàn)多維度、多參數(shù)的單細(xì)胞定量信息獲取，對(duì)于細(xì)胞分型、鑒定以及單細(xì)胞水平的疾病相關(guān)分子機(jī)制研究具有重要意義。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)方興未艾，但針對(duì)單細(xì)胞中蛋白質(zhì)和代謝物的分析技術(shù)仍非常有限，尤其是大量蛋白質(zhì)和代謝物的同時(shí)分析尚未見(jiàn)報(bào)道。熒光流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)單細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，然而光譜帶寬重疊問(wèn)題限制了其同時(shí)測(cè)定的通道數(shù)。以CyTOF為代表的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞中40余種蛋白質(zhì)的同時(shí)定量分析，但其依賴于ICP-MS儀器，且ICP-MS無(wú)法提供細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，極大地限制了方法的檢測(cè)對(duì)象；有機(jī)質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定能力強(qiáng)、質(zhì)量分辨率高，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞中小分子代謝物的分析。基于有機(jī)質(zhì)譜建立流式細(xì)胞分析新方法，從而獲取單細(xì)胞中蛋白組、代謝組等多組學(xué)信息，在單細(xì)胞異質(zhì)性相關(guān)研究具有不可替代的分析優(yōu)勢(shì)。

北京大學(xué)劉虎威/白玉課題組于2019年報(bào)道的工作利用新型兼具質(zhì)譜增敏和信號(hào)放大策略的質(zhì)譜探針，構(gòu)建了常壓質(zhì)譜免疫分析平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了zmol的蛋白質(zhì)檢出限以及最低13個(gè)細(xì)胞表面3種蛋白質(zhì)的定量分析（J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 72-75）。最近，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)質(zhì)譜探針進(jìn)行拓展，并利用基于狄恩流的微流控芯片實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞排列，結(jié)合納升電噴霧-高分辨質(zhì)譜（nanoESI-HRMS），搭建了多維度有機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞分析平臺(tái)（圖1）。該平臺(tái)能夠高通量地對(duì)單細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)和代謝物等多維度的信息進(jìn)行同時(shí)獲取。相關(guān)成果2020年10月21日以“Multi-Dimensional Organic Mass Cytometry: Simultaneous Analysis of Proteins and Metabolites on Single Cells”為題在《Angewandte Chemie International Edition》雜志在線發(fā)表。

圖1 多維度有機(jī)質(zhì)譜流式分析平臺(tái)

該工作中設(shè)計(jì)并合成了一系列基于羅丹明質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)譜探針，對(duì)單細(xì)胞表面的CA125，CEA，EpCAM，CD24，CD44和CD133等重要的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)記；標(biāo)記的細(xì)胞利用基于迪恩流的微芯片實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞排列，并利用nanoESI-HRMS實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞檢測(cè)。離子化過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)簽的高效解離和細(xì)胞內(nèi)容物的有效釋放，從而確保了單細(xì)胞中蛋白質(zhì)和代謝物信息的同時(shí)獲取。該質(zhì)譜流式分析平臺(tái)成功實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平6種目標(biāo)蛋白質(zhì)及84種代謝物的同時(shí)檢測(cè)，證實(shí)了蛋白質(zhì)和代謝物在細(xì)胞個(gè)體間的顯著差異性（圖2）。

圖2 A2780細(xì)胞質(zhì)譜流式分析結(jié)果

基于該多維度有機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞分析平臺(tái)所獲取的信息，工作首次同時(shí)利用蛋白質(zhì)及代謝物信息作為細(xì)胞分型依據(jù)，在5種腫瘤細(xì)胞的PCA分析中獲得了更好的鑒定和分型結(jié)果。在利用Ward’s法得到的聚類結(jié)果中，相比于利用單一的蛋白質(zhì)或代謝物信息，使用蛋白質(zhì)和代謝物的綜合信息能夠獲得更高的分型靈敏度和特異性。單細(xì)胞分析方法在干細(xì)胞研究、細(xì)胞耐藥性研究以及癌癥治療等方面具有重要意義，該流式平臺(tái)還成功實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞耐藥異質(zhì)性分析，其結(jié)果有望為分子水平的耐藥性細(xì)胞研究或癌癥干細(xì)胞研究提供分析依據(jù)（圖3）。

圖3 細(xì)胞分型和腫瘤耐藥差異性結(jié)果圖

近幾年來(lái)，劉虎威/白玉課題組致力發(fā)展基于質(zhì)譜的復(fù)雜生物體系中痕量生物標(biāo)志物分子的高效、高靈敏和高通量測(cè)量新方法和新應(yīng)用。本工作第一作者為15級(jí)博士研究生徐姝婷，白玉副教授為文章的通訊作者。研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委和科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目的資助。上述內(nèi)容已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)際專利PCT（PCT/CN2020/083482）。

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