多細胞肝球作為一種3D培養模型，可用于肝纖維化治療的研究，雖然這些模型可以再現纖維化疾病，然而目前通過隨機分配方法制造的細胞球不易控制，在大小、功能和效用上存在著差異。近日，來自美國加利福尼亞大學的Adam R Abate團隊在Biofabrication上發表題為“Controlled fabrication of functional liver spheroids with microfluidic flow cytometric printing”的研究新成果。研究人員利用微流控流式細胞打印（μFCP）技術，可實現單細胞打印，得到具有確定數量的不同細胞類型的肝球。該技術制造的細胞球在結構與功能上的均勻性均優于隨機分配方法生成的細胞球。此外，該技術每小時產生數千個細胞球，可批量制造單細胞精度的球狀體，為疾病建模和高通量藥物測試提供可擴展平臺。

μFCP技術工作原理

細胞識別及分揀是實現精確分配細胞的關鍵。與傳統的FACS工作原理一樣，μFCP技術通過熒光和散射特性鑒定出目標細胞，并從流體中分揀出來。不同之處是，該技術提出了介電泳液滴偏轉裝置，利用導電液滴和周圍絕緣空氣之間的介電常數差異，實現目標細胞的分揀。該裝置體積小至毫米，因此允許靠近接收板，從而提高打印精度。當載有目標細胞如肝細胞（HepG2）或肝星狀細胞（HSC）的液滴流過分揀區域時，液滴將按需沉積在所需孔內，最終形成功能性肝球（如圖1）。

圖1 μFCP技術制造功能性肝球示意圖

μFCP技術制造的細胞球具有更好的細胞存活率

當用懸浮細胞組成細胞球時，并非所有的細胞都是活的，隨機分配法會將死亡的細胞也包含在在細胞球中，導致細胞球的特征發生改變。相比之下，μFCP技術可以使用活性染料辨別出死細胞并將其排除，從而提高細胞球活性。為了驗證這一點，研究人員將Calcein AM染色后的細胞分別通過隨機分配法和μFCP技術打印在基底上（如圖2），結果表明μFCP技術獲得的細胞群體具有更高的平均熒光，且暗淡的細胞較少。進一步對細胞群體進行EthD-1染色，也同樣觀察到μFCP技術下的死細胞更少。

圖2 μFCP技術可分揀活細胞，以提高細胞球活性

μFCP技術制造的細胞球大小和細胞組分精準可控

細胞球的大小取決于培養時間和初始細胞數量。為了說明μFCP技術在控制細胞球大小方面的優越性，研究人員使用μFCP和隨機分配兩種技術打印了不同初始細胞數量。與隨機分配方法相比，μFCP技術打印的細胞球尺寸分布更集中（圖3a）。為了展現μFCP技術具有精準控制細胞球成分的能力，研究人員使用這兩種方法構建了目標成分為10個HepG2和10個HSC的細胞球，μFCP制造的細胞球細胞數量的標準誤差明顯小于隨機分配（圖3b），并且在培養六天后的尺寸變化比隨機分配所產生的細胞球小三倍（圖3c）。

圖3 μFCP技術允許打印的細胞數目可控，以獲得更均勻的肝細胞球

μFCP技術制造的肝細胞球功能可控

纖維化取決于肝細胞和肝星狀細胞之間的相互作用。因此，這些細胞比例的變化可能導致不一致的細胞球功能。為了研究細胞比例對肝球表型和纖維化的影響，研究人員打印了不同比例的HepG2和HSC細胞球，每個細胞球共有100個細胞。培養6天后，細胞球大小隨著HSC數量的增加而減?。▓D4a、b），且球體形態趨于球形（圖4c）。但當HSC增加超過60%會導致球體形態不規則。為了更深入地研究這一點，研究人員量化了I型膠原蛋白的生成，當HSC占比低于50%時，I型膠原蛋白總量隨HSC數量線性增加，反之下降（圖4e、f），這表明當HepG2過少時，HSC不再分泌膠原蛋白。

圖4 μFCP技術允許系統化研究細胞類型的比例和數量對肝球的影響

μFCP技術制造的細胞球可以實現更精確的藥物篩選

使用細胞球進行藥物篩選時，其大小和功能均勻性直接影響準確性。由于μFCP允許制造具有優異均勻性的細胞球，因此與隨機分配方法相比，它能夠實現更精確的篩選。為了評估藥物反應的可變性，研究人員通過打印或隨機分配的方式，用60個HepG2和40個HSC細胞制作了細胞球（圖5a）。然后使用TGF-β1促纖維化化合物處理細胞球，這是一種對HSC活化的有效刺激，可產生I型膠原（圖5b、c）。為了比較功能均勻性，研究人員通過計算I型膠原面積來量化I型膠原的數量（圖5d），發現TGF-β1顯著增加μFCP打印細胞球和隨機生成細胞球中的I型膠原，與隨機分配的細胞球相比，打印細胞球的測量可變性降低，大大增加了藥物影響的統計顯著性。

圖5 μFCP技術制造的細胞球用于體外藥物精準測試

目前基于隨機分配制造的肝細胞細胞球存在尺寸和功能可變的問題，這限制了它們再現肝臟生物學和纖維化的重復性，以及作為篩選模型的準確性。研究人員采用的微流控流式細胞打印技術克服了這些問題，確保了細胞球由所需細胞類型的確切數量組成。此外，若將該技術與多路復用光學檢測相結合，可進一步增加細胞球的復雜度，這將有利于細胞球功能的精準控制。