疑問：

查詢抗體的時候，發(fā)現(xiàn)在抗體應用欄中，有的抗體適用于WB、IP、IHC、IF、F、CHIP等所有實驗，而有的抗體適用于WB、IHC、IF、F，不適用于IP和CHIP?科研人員都傾向使用一種抗體將預計的實驗做完，避免去尋找其它抗體，所以首選能通用抗體。

而上一篇《WB，IP，IHC，IF，ChIP，F(xiàn)C抗體的區(qū)別?》提出WB，IP，IHC，IF，ChIP，F(xiàn)C抗體為什么不能通用?其中WB抗體是識別線性抗原表位的抗體，而其它方法學需要針對識別構象抗原表位的抗體。這就導致WB抗體不適用其他方法學。

疑問出現(xiàn)：一會說首選能通用的抗體，一會又說抗體為什么不能通用。這究竟是怎么回事?

為了解釋上面提到的疑問，首先需要了解決定抗原特異性的抗原表位;同時了解抗體的兩種分類：單克隆抗體和多克隆抗體。

抗原特性：

抗原的特異性是免疫學檢測、診斷及防治的分子基礎和理論依據(jù)，而決定抗原特異性的結構基礎就是存在于抗原分子中的抗原表位(epitope)。根據(jù)抗原表位的空間結構特點可將其分為順序表位(sequential epitope)和構象表位(conformational epitope)。順序表位由肽鏈上一段序列相連續(xù)的線性氨基酸殘基所構成，又稱線性表位。順序表位存在于抗原分子的任意部位。構象表位由多肽或多糖鏈上空間位置相鄰，而序列上不相連續(xù)的氨基酸或多糖殘基所構成。

抗體分類：

單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤(hybridoma)抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。

多克隆抗體(polyclonal antibody， pAb)：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆，相應地就產生針對多種抗原表位的多種單克隆抗體，所獲得的免疫血清實際上是含有多種單克隆抗體的混合物，即多克隆抗體。

如果制備抗體的抗原，既含有線性抗原表位，又含有構象抗原表位，并且抗體識別的抗原表位和該蛋白質與目標物質結合的部位不一致的情況下，同時以多克隆形式呈現(xiàn)的抗體，那么此抗體就有可能成為通用抗體(具體還得以實驗數(shù)據(jù)為準，因為抗體研發(fā)出來之后都要經過WB，IP，IF，IHC等實驗驗證才能最終確認其適用范圍)。

另外，如果抗體識別的抗原表位和該蛋白質與目標物質結合的部位一致的情況下，則會導致Co-IP，CHIP實驗的失敗。這也就出現(xiàn)前面疑問提到：有的抗體適用于WB、IHC、IF、F，不適用于IP和CHIP。

如果制備的抗體的抗原只含有線性抗原表位，那此抗體通常情況下只適用于WB實驗。因為其他方法學的目標蛋白一般無需經過變性處理，需要用抗體去識別天然狀態(tài)下的蛋白質，目標蛋白可能既含有線性抗原表位，又含有構象抗原表位，如果線性抗原表位暴露在蛋白質表面，沒有包裹在蛋白內部而無法識別，那此時的WB抗體也有可能適用其他方法學。

有的實驗為了特異性，選擇單克隆抗體，那此時抗體的適用范圍就會變窄。但也有特殊情況，例如圖一中Rb(4H1)Mouse mAb(9309)，此抗體為單克隆抗體，但是經過實驗驗證，發(fā)現(xiàn)其居然適用WB、IP、IHC、IF、F、CHIP等所有實驗。推測此抗體的抗原只含有線性抗原表位，并且抗原表位暴露在蛋白質表面，沒有包裹在蛋白內部而無法識別，那這個抗體就有可能適用上述提到所有方法學實驗，在適用范圍驗證過程中也恰好證明如此。

綜上，一個抗體的適用范圍是由抗原決定簇決定的，包含線性抗原表位或者構象抗原表位;抗體識別抗原表位是否影響該蛋白與目標物質的結合;同時又取決于抗體是單克隆抗體或者多克隆抗體。

單克隆特異性好，應用范圍有限;多克隆抗體猶如多種單克隆抗體的混合物，它們有的特異性高，有的特異性低，總體特異性符合正態(tài)分布曲線的形式，適用范圍更廣。但是具體到使用單抗還是多抗，則需要具體問題具體分析。比如檢測的蛋白濃度低，用多抗檢測到的可能性會比單抗高。又或者待檢測蛋白被分割成兩段，那就需要針對識別兩段抗原表位的多抗。

題外：

關于假陽性

根據(jù)抗體最核心的表位結合區(qū)域—互補決定區(qū)(Complementarity Determining Region，CDR)的結構，抗體通常可以緊密結合的抗原表面區(qū)域或表位面積很小，對于變性的肽段約在4-8個Aa以內，以及5-7個單糖的糖鏈或6-8個核苷酸的核酸。通過肽段BLAST可以得知，小肽段序列完全相同的情況將在很多不同蛋白上發(fā)生。這意味著單抗識別的這個表位可能并不僅僅屬于靶標蛋白本身，也即意味著，即使利用純化抗原蛋白進行了特異性篩選的單克隆抗體，當用其檢測復雜樣本時，也將面臨交叉反應或假陽性問題。

靈敏度

特異性決定了假陽性結果的多少，敏感性決定了檢出率的高低。在復雜樣本中，由于多克隆抗體識別抗原的多個表位，可以在一個抗原分子上結合更多的抗體分子，也可以在當部分抗原表位受到一定程度的遮蓋或破壞時，仍有抗體結合在未受影響的表位上。這種情況常發(fā)生在如石蠟包埋的免疫組化(IHC-P)等實驗中，當樣本經甲醛交聯(lián)固定后，即使經過抗原修復，抗原表位也不可避免地受到了影響，此時單克隆抗體由于只識別一個表位，結合能力可能大大降低甚至呈現(xiàn)陰性結果，而只要不是所有表位都受到了破壞，多抗仍可以獲得該靶點的陽性結果。同樣的，對于樣本中一些表達豐度極低的蛋白，由于多表位結合更多抗體分子，檢測信號就將被放大。因此，使用多抗具有靈敏度和檢出率上的優(yōu)勢。