免疫細(xì)胞分泌功能（Immune cell secretion）的調(diào)控是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵所在。例如，細(xì)胞免疫療法的成敗與免疫細(xì)胞是否能正確分泌殺傷性細(xì)胞因子（Cytotoxic cytokines）緊密相關(guān)。傳統(tǒng)研究方法，如流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry），在處理大量細(xì)胞樣本時(shí)效率不高，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞分泌蛋白的高通量時(shí)空間分析。

而目前已發(fā)表的關(guān)于新型單細(xì)胞微流控分析系統(tǒng)的研究，例如基于納米孔陣列的微流控分析方法，能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞的分泌行為進(jìn)行實(shí)時(shí)的時(shí)空間監(jiān)控，從而以極高的分辨率揭示單細(xì)胞分泌的特性。然而，這類方法只能同時(shí)檢測(cè)幾百個(gè)單細(xì)胞，在通量上存在明顯不足，這進(jìn)一步限制了將這類方法與高通量篩選相結(jié)合的潛力。目前，我們對(duì)細(xì)胞分泌行為的理解仍非常有限。

近期，美國(guó)西北大學(xué)（Northwestern University）及陳·扎克伯格生物研究所（Chan Zuckerberg Biohub Chicago）的Shana O. Kelley研究小組在Nature Biomedical Engineering期刊上發(fā)表了題為“Identification of druggable regulators of cell secretion via a kinome-wide screen and high-throughput immunomagnetic cell sorting”的研究論文，報(bào)道了一種用于檢測(cè)大量免疫細(xì)胞分泌行為的高通量微流控方法。該方法結(jié)合了免疫細(xì)胞分選和CRISPR篩選，成功鑒定了調(diào)控小鼠CD4+ T細(xì)胞中干擾素-γ分泌的關(guān)鍵激酶。

在之前的研究中，Shana O. Kelley研究小組報(bào)道了一種全新的細(xì)胞分選方式——免疫細(xì)胞磁性親和力靶向（Magnetic affinity targeting of immune cells，MATIC）。該方法能夠根據(jù)細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)量，通過磁力以每小時(shí)數(shù)以億計(jì)的速度分選目標(biāo)細(xì)胞，使得對(duì)各類細(xì)胞亞群的快速分選和鑒定成為可能。在此次的研究中，Shana O. Kelley研究小組針對(duì)細(xì)胞分泌行為重新設(shè)計(jì)了磁力分選的機(jī)制。具體來說，研究人員設(shè)計(jì)了一種在細(xì)胞表面原位捕捉分泌蛋白的策略，稱為基于分泌的細(xì)胞排序和富集（Secretion-enabled cell ranking and enrichment，SECRE）。

SECRE通過在細(xì)胞表面進(jìn)行多輪的抗體功能化，在細(xì)胞表面進(jìn)行了類似酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（On-cell ELISA）的反應(yīng)。研究人員在對(duì)SECRE進(jìn)行優(yōu)化之后，成功實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞表面對(duì)分泌蛋白的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)及磁球標(biāo)記。標(biāo)記后的細(xì)胞可以通過已有的MATIC系統(tǒng)進(jìn)行快速分選，以篩選出蛋白分泌量高、中等及低的免疫細(xì)胞亞群。

利用SECRE方法在細(xì)胞表面進(jìn)行ELISA反應(yīng)來鑒定特定蛋白的分泌

利用開發(fā)的SECRE方法，研究人員對(duì)CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行了全基因組CRISPR篩選，并以T細(xì)胞分泌干擾素-γ的能力為依據(jù)進(jìn)行了細(xì)胞分選。測(cè)序結(jié)果表明，在分泌能力低的細(xì)胞亞群中，許多特定的激酶有著重要的影響，包括ACVR1、LRRK、STK10、STK24和SLK等。大部分激酶都有對(duì)應(yīng)的小分子抑制劑，這使得對(duì)這些激酶通路的功能驗(yàn)證變得簡(jiǎn)單且容易。研究人員在相同的激活條件下，加入了不同的激酶來抑制CD4+ T細(xì)胞的干擾素-γ分泌。最終發(fā)現(xiàn)，XMU-MP1（SLK抑制劑）、SB-633825（STK10抑制劑）和Bosutinib（STK24抑制劑）具有最佳的抑制效果。

SECRE與CRISPR篩選方法相結(jié)合，可識(shí)別干擾素γ分泌的調(diào)控因子

最后，研究人員在動(dòng)物模型上展示了小分子抑制劑的治療潛力。具體來說，他們構(gòu)建了一個(gè)基于硫酸葡聚醣（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型。在這類模型中，T細(xì)胞干擾素-γ的分泌在結(jié)腸炎的進(jìn)展中起了關(guān)鍵性的作用。以往的研究已經(jīng)證明過量的干擾素分泌會(huì)引起腸道干細(xì)胞的死亡和腸道上皮細(xì)胞的感染。通過使用XMU-MP1，研究人員將小鼠體內(nèi)干擾素-γ的分泌量降低到了正常水平，這極大地減緩了結(jié)腸炎的發(fā)展。與DMSO對(duì)照小鼠相比，在XMU-MP1治療的小鼠體內(nèi)，腸道的多項(xiàng)指標(biāo)均恢復(fù)了正常，包括腸道的長(zhǎng)度、感染水平及Olfm4+的腸道干細(xì)胞數(shù)量。這進(jìn)一步證明了基于SECRE方法的CRISPR篩選可以快速鑒定針對(duì)細(xì)胞分泌的治療靶點(diǎn)和小分子藥物。

硫酸葡聚醣（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中干擾素-γ抑制劑的抑制作用驗(yàn)證

綜上所述，這項(xiàng)研究不僅在細(xì)胞分析行為的檢測(cè)上實(shí)現(xiàn)了技術(shù)創(chuàng)新，更在免疫細(xì)胞分泌的分子機(jī)制的研究中提供了新的視角和可能性。未來，這種高通量微流控技術(shù)在免疫療法和疾病治療研究中的應(yīng)用前景值得期待。特別是對(duì)于自身免疫性疾病，該技術(shù)的應(yīng)用可能有助于快速發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和小分子創(chuàng)新藥，從而為患者提供更有效的治療方案。







審核編輯：劉清