細(xì)胞外囊泡（EVs）作為各種疾病的生物標(biāo)志物正迅速受到研究人員的青睞，其可以充當(dāng)來源細(xì)胞的寶貴信息載體。然而，盡管細(xì)胞外囊泡具有重要價值，但其在臨床實踐中的應(yīng)用仍然有限。在眾多限制因素中，最關(guān)鍵的因素之一是分離細(xì)胞外囊泡所面臨的挑戰(zhàn)。事實上，目前采用的主流細(xì)胞外囊泡分離方法存在分離純度低、通量小以及重現(xiàn)性差等問題。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，為解決上述問題，近期，來自意大利帕多瓦大學(xué)（University of Padova）等機(jī)構(gòu)的研究人員開發(fā)了一種液滴微流控平臺，該平臺能夠利用磁珠的免疫捕獲親和力，實現(xiàn)細(xì)胞外囊泡的高效分離。該平臺能夠在相對較短的時間內(nèi)（4.5小時）處理大量樣品（2 mL），并且其自動化程度相當(dāng)高。

此外，研究人員將基于液滴微流控平臺的細(xì)胞外囊泡分離方法與市售方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，基于液滴微流控平臺的細(xì)胞外囊泡分離方法所需的孵育時間更短（市售方法所需的孵育時間為其2.5倍），捕獲效率更高（其捕獲效率為市售方法的2.5倍）。相關(guān)研究成果以“Droplet microfluidic platform for extracellular vesicle isolation based on magnetic bead handling”為題發(fā)表在Sensors and Actuators B: Chemical期刊上。

具體而言，研究人員首先介紹了其開發(fā)的液滴微流控平臺。如圖1所示，為分離細(xì)胞外囊泡而開發(fā)的液滴微流控平臺由三個連續(xù)的自動化模塊組成：（1）液滴生成器；（2）液滴孵育器；（3）磁珠提取器。各模塊由注射器或壓力控制器控制。實驗開始前，將含有磁珠和細(xì)胞外囊泡的樣品先存放在一個搖動裝置中，以防止磁珠沉降。在通過雙T型接頭生成液滴的過程中，啟動注射器并將控制器的壓差（ΔP）設(shè)為零，同時保持閥門關(guān)閉，以便使液滴從出口5流出PDMS基微流控芯片（見圖1）。注入微流控芯片中的分散相和連續(xù)相的流速可以調(diào)節(jié)，以獲得所需大小的液滴。經(jīng)過適當(dāng)優(yōu)化后，最終將載體油、水性樣品和礦物油的流速分別設(shè)定為30 μL/min、250 μL/min和60 μL/min，從而生成體積為980 ± 60 nL的液滴。

用于分離細(xì)胞外囊泡的液滴微流控平臺及其工作流程示意圖

當(dāng)所有的起始樣品都被分散生成液滴后，關(guān)閉注射器，打開閥門，并啟動壓力控制器，以控制液滴的運動。具體而言，通過交替施加正負(fù)壓差（50 ~ 200 mbar），在毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行的時長可調(diào)的孵育過程中，液滴會來回運動，從而促進(jìn)其內(nèi)容物的混合，并進(jìn)一步增加細(xì)胞外囊泡與磁珠相遇和結(jié)合的幾率。

孵育結(jié)束后，閥門被再次關(guān)閉，利用與入口1連接的注射器將液滴引導(dǎo)至微流控平臺的第三個模塊——磁珠提取模塊中，以提取磁珠。在該模塊區(qū)域，將磁化金屬尖端靠近毛細(xì)管，從而可以在母液滴流動時從其中提取磁珠。一旦液滴完全從磁化金屬尖端前方通過，磁珠被完全捕獲，磁珠團(tuán)便會被包裹在一個微小的液滴中。液滴最終的體積取決于磁珠的數(shù)量，通常，當(dāng)磁珠的數(shù)量在10?到10?之間時，生成的液滴的體積在5 nL到50 nL之間。

隨后，將磁鐵從毛細(xì)管附近移開，磁珠會從毛細(xì)管中流出。將其收集到預(yù)裝入水溶液的常規(guī)PCR管中，用于隨后的細(xì)胞外囊泡分析。總而言之，只需將磁化金屬尖端從磁珠提取模塊區(qū)域移開幾毫米，使磁珠不再受到磁力作用，就能輕松完成磁珠的提取。

液滴內(nèi)磁珠捕獲效率的表征

在后續(xù)的研究過程中，研究人員對開發(fā)的微流控平臺進(jìn)行了表征，并展示了利用生物樣本對微流控平臺的性能進(jìn)行驗證的結(jié)果。此外，通過蛋白質(zhì)表征、細(xì)胞外囊泡定量和成像等手段，研究人員將基于液滴微流控平臺的細(xì)胞外囊泡分離方法與傳統(tǒng)的超速離心法和商業(yè)試劑盒方案進(jìn)行了系統(tǒng)地比較。最后，研究人員還對分離出的細(xì)胞外囊泡的microRNA含量進(jìn)行了評估。

液滴微流控平臺對不同起始樣品量（V = 50 ~ 2000 μL）的處理能力

液滴微流控平臺分離細(xì)胞外囊泡的性能驗證

綜上所述，在這項研究中，研究人員提出并驗證了一種基于液滴微流控技術(shù)和磁珠的新型平臺，并將其成功用于分離細(xì)胞外囊泡。值得注意的是，與使用市售方法相比，液滴微流控技術(shù)可以在更短的孵育時間內(nèi)將捕獲效率提高2.5倍。此外，與單相微流控器件相比，該研究提出的微流控平臺在樣品量（最多2 mL起始樣品）和分析通量（超過400 μL/h）方面也有顯著提高。因此，可以認(rèn)為，使用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞外囊泡分離在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面都具有巨大潛力。不過，對于臨床樣本（如血漿或血清）的處理，可能需要對表面活性劑進(jìn)行專門優(yōu)化，以確保液滴的穩(wěn)定性，同時還需要對用于免疫捕獲的磁珠涂層進(jìn)行優(yōu)化。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.135583

審核編輯：劉清